透視大腦神經圖譜

神經科學

2021/03/02 撰文／陳其暐 攝影／王竹君

大腦運作何其複雜？若能描繪出大腦神經連結的圖譜， 意識之謎、各種腦部病變都可能獲得解答。這個極富開創性的跨領域 挑戰，需要環環相扣的研究策略。

實驗室裡一片漆黑，沒有任何研究人員在場，卻隱隱傳出儀器的低鳴聲，「超解析光學顯微鏡」連結著電腦，正在自動運作。從簾幕的細縫看去，一台電腦螢幕透出紅綠交雜的光芒，畫面上「半幅」組織影像則是後方「受激拉曼散射顯微鏡」（stimulated Raman scattering microscopy）運算出來的資料：研究人員正在發展一種關鍵技術，以偵測特定單一分子在活體果蠅腦中的分佈，可得到奈米（nm）尺度的功能性圖譜。

這裡是清華大學腦科學研究中心。走在白色長廊上，兩側的房間內都是與果蠅相關的各種實驗設施，腦科學研究中心主任江安世隨手打開一間實驗室的門，我們看到與剛才截然不同的場景—裡頭十分明亮，讓人不由得注意到實驗桌旁堆疊的許多試管架，上面插滿試管，每支試管都飼養了近百隻的果蠅。好幾位研究人員正在實驗桌上仔細處理果蠅，根據實驗設計一隻隻解剖、取出大腦，以便置於顯微鏡下觀察，進而驗證大腦運作的假說。

清華大學腦科學研究中心邀請了台灣各領域將近50個傑出的實驗室合作研究，有些科學家正在研發如何提升顯微影像的技術，也有人鑽研神經元的運作機制、探索記憶如何形成，還有團隊專注開發巨量資料演算法以處理龐大數據。這些看似領域迥異的團隊，共同的目標就是：繪製世界上第一幅完整的果蠅大腦神經網路連接圖譜，破解大腦運作的謎團。

為什麼是果蠅？

然而，為什麼這個堪稱全台灣走在神經科學最前端的腦科學中心，做的只是果蠅大腦的神經圖譜？事實上，這也是江安世常被詢問的問題：為什麼是果蠅腦，而不直接做人腦？

人腦的運作方式一直是個謎團，即使現代科技已能探索5500萬光年外的黑洞，也能夠製造出5奈米的積體電路，但對於人類自己的大腦，我們所知仍然極為有限。當人感到開心時，大腦中哪些神經元活化了？在思考問題時，大腦訊號如何傳遞？整個大腦的資訊如何流動、如何處理、如何影響我們做決定？各神經元的活動與認知行為的關聯是什麼？看似簡單的問題，科學家卻無法精確解釋，更別說是面對阿茲海默症這類無藥可醫的腦部疾病。若能知道完整的人腦神經圖譜，包括每個神經元的分佈位置與突觸連接方式，這些問題就有可能迎刃而解。也因此，探索人腦的奧秘成為所有神經科學家的終極聖杯。

事實上，江安世也是為了探究人腦奧秘，投入神經科學研究近30年。但在實際研究人腦之前，「為什麼要做果蠅這種模式生物？因為牠能讓我們練習。」江安世解釋，透過成本低廉的果蠅，能幫助科學家累積必要的基礎知識與技術。

建構人腦圖譜所需的資金是以百億美元為單位，為了能在未來一舉成功，科學家必須透過果蠅演練實驗流程，找出最適合人腦圖譜的研究方法。「科學家用果蠅做實驗，其實已經有好幾百年了。」果蠅體型小、飼養成本低、世代間隔短、在基因調控上相當便利，因而受到許多科學家青睞，江安世也是其中之一。

話說在破解大腦奧秘之前，生命科學領域上一項投入龐大資金、集結眾多科學家攜手研究的課題，是1990年代由美國、英國、德國、日本等國合作的「人類基因組計畫」（Human Genome Project, HGP），目標是解讀人類完整的基因序列，藉此了解基因運作的奧秘。整個研究過程投入超過47億美元，最終在2003年達成任務，長達30億個鹼基對的人類基因組序列公諸於世，開創了生命科學的新紀元。

1992年江安世從美國回到清華大學任教時，那場基因定序競賽才剛開始。他也曾考慮是否成為其中一份子，但他天生就有某種反骨基因，「我要做跟別人不一樣的事情。」江安世思考的是，在解讀出人類基因組序列之後，下一個重要的議題是什麼？這議題必須是他能夠貢獻己力、在台灣有限的資源下能有機會解決、並且使台灣能讓全世界看見的重要問題。

江安世想到的議題是：基因在生物體內會如何表現？能否實際利用光學顯微鏡看到基因表現的狀況？但這個看似簡單、直接的議題，卻有一個大障礙。

透明液開啟新視界

就像學生實驗在光學顯微鏡下觀察單層口腔黏膜細胞一樣，當生物組織的厚度夠薄，就可以透光藉由光學顯微鏡觀察結構。因此100多年前聰明的科學家把富含水份的組織脫水後包埋進蠟塊當中，利用鋒利的刀片切下約一層細胞厚度的薄片，利用這樣的薄片，科學家記錄了多種組織中的結構及其組成細胞。但這個方法無法觀察生物組織的立體結構，更無法與現今生命科學實驗普遍應用的螢光染色或綠色螢光蛋白（GFP）同時使用，讓江安世想要發明一種新的方法，來突破這樣的限制。

「組織脫水包埋後，大多數的螢光染劑分子都會被破壞，螢光蛋白則因結構改變，而大幅減弱發光特性。」要透過顯微鏡看到組織細胞裡的螢光，必須先讓組織切片變透明。不過江安世自嘲，這個想法當時僅只是他的幻想。

「有些生物例如蚜蟲、水母是透明的，所以我們知道生物組織在水溶性自然環境下，也可以是透明的。」抱持這樣的信念，江安世開始嘗試各種配方，他找出製作透明標本的關鍵是「甘油」，組織泡在甘油裡會呈現半透明的狀態。甘油的化學結構裡有三處可以接上碳鏈，於是江安世嘗試在此接上不同長度的碳鏈，結果發現「碳鏈越長，組織越透明。」特別是碳鏈長度六至七個碳時，組織會變得最透明。

「我搜尋了不到200種化合物，就找出透明液的最適成份，那是一種稀有的醣類分子。」透明液可以讓生物組織與光的折射係數匹配，使組織透明到仿若在眼前消失。不但如此，這種技術幾乎不會破壞生物組織的結構，有助於觀察細胞的真實樣貌。這個名為「FocusClear」的透明液配方，是江安世在追尋大腦圖譜的過程中發明的第一項關鍵技術。

2001年，江安世在博士班指導教授夏爾（Coby Schal）的引薦下，前往美國冷泉港實驗室。在生命科學領域，冷泉港實驗室是全世界首屈一指的研究單位，引領國際上許多重要的研究方向。江安世當時尚未成名，那一年美國又發生911事件，江安世的加入並未引起這些學者的注意。直到他偶然看到一名研究人員拍攝的果蠅蕈狀體影像十分模糊，因此拿出他所開發的FocusClear，立刻得到極為清晰的影像，頓時轟動整個冷泉港實驗室。

由於FocusClear可以把幾乎所有的生物組織變得澄清透明，江安世就與冷泉港的研究人員把鼠腦透明化，首次得以描繪海馬迴中所有幹細胞的立體分佈。許多科學家搶著與江安世合作，短短六個月，他就與當地研究人員進行了近10項研究計畫。回憶這段過往時光，他強調：「台灣的人力資源、資金都有一定的限制，新的技術非常重要，讓我們可以在國際上競爭，產生新的結果，改變整個局面。」

在透明液的幫助下，江安世擁有許多與國際學者合作的機會，讓江安世在清華大學的實驗室一步步成為國際級研究團隊。也因此，江安世選擇以果蠅做為了解大腦運作的模式生物，透過果蠅理解大腦運作的基本現象，未來可以把相關知識應用在哺乳類動物、甚至人類，省去許多試誤（trial and error）。

江安世實驗室首先嘗試繪製「果蠅的嗅覺圖譜」。過去科學家已發現動物之所以能感知周遭不同氣味，是因為鼻子裡有嗅覺神經元，這些嗅覺神經元在接收化學分子後，會把訊號傳達到大腦裡，進而做出喜歡或討厭等特定的反應。但科學家並不知道訊號究竟如何傳遞，以及傳遞到大腦何處？江安世利用共軛焦顯微鏡，並配合FocusClear透明液與螢光蛋白技術，在三維空間下觀測果蠅的腦細胞反應，重組果蠅嗅覺的大腦神經圖譜，因而發現有高層次的腦神經細胞專門處理不同嗅覺訊號，進而傳送到腦部特定區域。2007年，江安世與博士生林暉皓（現為美國加州大學聖地牙哥分校博士後研究員）確認了哪些神經細胞會對特定的氣味有所反應，並繪製出果蠅的嗅覺圖譜，完成了第一篇由台灣人發表於《細胞》的論文。

緊接著在2012年，江安世與博士生陳俊朝（現為清華大學助理研究員）進一步發現果蠅產生長期記憶的關鍵：只要用蓖麻毒素（ricin）抑制一顆特定的背前外側（dorsal-anterior-lateral, DAL）神經元中的蛋白質合成，就會損害果蠅的長期記憶；用同樣的方法干擾傳統上認為是學習與記憶中心的蕈狀體，反而不影響長期記憶，推翻了過往的假設。

精進光學顯微鏡解析度

然而，在研究大腦圖譜上，僅有FocusClear還不夠，江安世希望能「更快速、大體積、高解析」觀察生物組織。「生醫研究的進步跟能夠『看到』息息相關。因為顯微鏡的發明，人類才知道生物是由細胞組成的。」江安世解釋，大約100年前電子顯微鏡發明後，人類發現細胞裡面原來還有更微小的胞器；21世紀初，科學家發展出超高解析度的螢光顯微鏡，能夠突破光學極限，達到接近電子顯微鏡的解析度，而且運作速度更快。

為了觀察全腦神經連接，江安世與中央研究院應用科學研究中心副研究員陳壁彰合作，開發出「透化層光定位顯微鏡」（lightsheet localization microscopy），讓江安世等人能夠一次觀察到果蠅大腦內所有製造多巴胺的神經細胞，繪製出果蠅多巴胺神經網路。

發明透化層光定位顯微鏡的關鍵之一，是單分子定位顯微術（single molecule localization microscopy），這個技術的科學基礎是由2014年諾貝爾化學獎得主貝吉格（Eric Betzig）等人建立，而陳壁彰是貝吉格的門生。單分子定位顯微術可透過光敏蛋白產生很強的螢光，並降低背景雜訊，定位螢光分子的中央位置，可以分辨約30奈米的結構。江安世如此比喻這種技術：「白天星星在天空上，可是你看不到；但晚上天空變黑時，你就看得到一顆一顆的星星。」

然而只是單分子定位顯微術，還無法解決果蠅大腦透光率低、螢光蛋白表現分佈不均等問題。因此透過跨領域技術合作，利用江安世的FocusClear使果蠅大腦透明化，並在中研院物理所研究員胡宇光的幫助下修飾自發性閃爍螢光分子的結構，因此得以利用免疫螢光染色法標示特定蛋白質，不但解決上述問題，能夠觀察的組織深度也因此提升了數十倍。同時在層光顯微鏡的配合下，利用橫向光束精準激發觀察部位螢光分子以減少干擾，「透化層光定位顯微鏡」於焉成形，果蠅大腦多巴胺神經網路不僅是立體的，解析度又更上一層樓。

藉由自動化操作，透化層光定位顯微鏡能夠快速掃描整個果蠅大腦，一秒內成像數百萬個點，大幅提高獲取神經網路影像的速度。如此一來，科學家不僅能看得更清楚，還能同時處理大量樣本，累積更多可靠數據。

除了觀察大腦，江安世認為透化層光定位顯微鏡能有更多應用，「你可以看到每一個蛋白質分子在什麼位置，也可定量每個蛋白質分子在每個細胞裡的分佈。」像是觀察癌細胞標示蛋白質及藥物分子的定量分佈，進而選擇適合的治療方法。

江安世長期與胡宇光合作，希望利用同步輻射X光顯微成像技術來觀察更大組織的超解析結構，因為X光的波長短、解析度高，對生物組織的穿透力強，且能夠讓影像呈現很好的對比。江安世於2016年底受邀至美國聖地牙哥，在一年一度盛大舉辦的神經科學學會（Society for Neuroscience, SfN）年會的主席特別演講發表演說，演講中提及，以電子顯微鏡取像重組果蠅大腦神經連結的速度，繪製人腦神經網路圖譜約需1700萬年才能完成，X光顯微成像將大幅加快取像速度，隨即受到《自然》雜誌引用。為了加快速度，胡宇光與江安世等人在2020年1月共同發起成立SYNAPSE聯盟（Synchrotrons for Neuroscience -An Asia Pacific Strategic Enterprise），聯合新加坡、澳洲、中國、日本、韓國和台灣的六個同步輻射光源與專家，為解構人腦神經圖譜鋪路。SYNAPSE聯盟除了解決資源問題，也希望各國能共同建構高效率計算網路，來幫助處理、分析數據。在江安世與胡宇光的奔走下，位於新竹的同步輻射中心在2020年建置了一條專門用於腦科學研究的光束線（beamline），並將腦科學研究列為重點發展方向之一

挑戰一重又一重

然而，建構大腦圖譜，要突破的不只是顯微技術；分析大腦所產生的龐大數據量，也是江安世等人亟欲解決的問題。光是一顆果蠅大腦，所得到的數據量就高達20兆位元組（TB,1TB=1000GB），現在腦科學中心總共已累積了將近1 PB（1PB=1000TB）的數據，還因此建置一間機房專門管理數據庫。

分析數據的過程也不容易，掃描果蠅大腦後得到的數據需要經過前處理、確認細胞的結構與種類，並與其他資料做比對，才能真正開始分析、建構神經網路，並模擬大腦功能。江安世估計，未來建構人腦圖譜產生的數據量可能會接近10萬EB（1EB=1000PB），因此利用人工智慧（AI）處理巨量資料將是必要的手段。「假如我們有無窮的資源與人才，理論上不用五年就能解出果蠅大腦圖譜、模擬全腦功能，畢竟資料已經有了。但是我們缺乏更多建立資料庫、以AI自動分析資料的人才。」學界與業界的待遇差距大，讓江安世不容易找到適合的人才。

江安世面對的挑戰不只是科學本身，還有來自國際頂尖團隊的競爭。美國最具規模的生醫科學研究基金會「霍華休斯醫學研究院」為了研究神經科學，在2006年特別成立珍利亞農場研究園區（Janelia Farm Research Campus），目標之一即是解出果蠅大腦圖譜。在將近20億美元的挹注下，加上與Google合作，利用AI技術來自動辨識神經細胞，珍利亞研究園區目前解出約六分之一的果蠅大腦圖譜。

珍利亞研究園區的進度雖然不及江安世團隊，但由於珍利亞研究園區是利用電子顯微鏡切片的方法建構腦圖譜，解析度上比江安世採取的光學顯微鏡方法高，能確認神經細胞之間的連結狀況；江安世使用光學顯微鏡的好處除了速度快，實驗結果比電子顯微鏡相對容易重複驗證，能應用於研究大腦的功能運作狀況。因此江安世認為，最終兩種方法可能會殊途同歸、彼此互補，共同幫助建構完整的果蠅大腦結構及功能圖譜。

要繪製大腦神經圖譜，當然有其他團隊直接研究人腦。早在2013年，歐美就野心勃勃展開探索人腦的計畫。美國總統歐巴馬宣佈啟動「腦科學計畫」（BRAIN Initiative），預計投入45億美元，希望了解大腦運作的全貌，找出醫治各類腦部疾病的辦法，包括目前無藥可醫的阿茲海默症。同年，歐盟的「人腦計畫」（Human Brain Project, HBP）預計投入超過百億美元的經費，目標是建立一套人腦模擬系統，也就是透過超級電腦以模擬整個大腦的運作，還可取代動物實驗來開發藥物。然而HBP爭議不斷，至今尚未發表重大的科學成果。

科學家前仆後繼踏上研究人腦的道路，就是因為破解人腦運作會帶來超乎想像的影響，如同當年的人類基因組計畫。江安世說：「台灣的創新腦科技如果能成為完成人腦圖譜的關鍵技術，這將會是歷史性的一刻。」他深切希望，台灣不僅能參與這或許是科學史上最重要的研究，而且能在國際腦研究聯盟中扮演關鍵性的角色，與國際腦科學家一起探索科學最前沿的疆界。

【欲閱讀全文或更豐富內容，請參閱〈科學人知識庫〉2021年第229期03月號】